מדוע ניסוי ה- WB שלך נכשל בעקביות? בדוק את הסיבות הבאות!

כיום, בואו נדבר על הבעיה שגרמה לאינספור כאבי ראש של עמיתים למחקר - ניסוי Western Blot (WB). זה פשוט לכאורה אך מלא בניסוי "מלכודות", מדוע זה תמיד גורם לנו למעוד שוב ושוב? עכשיו בואו נסקור את הסיבות לכישלונות יחד.

I. אין להקות

סיבות אפשריות עשויות לכלול:

1. סוגיות נוגדנים: הנוגדן עשוי להיות לא יעיל, לא ספציפי או לא קשור לחלבון היעד.
2. בעיות מדגם: המדגם עשוי להכיל חומרים מפריעים, להיות נמוכים מדי בריכוז או כבר מושפלים.
3. בעיות אלקטרופורזה: תנאי אלקטרופורזה לא הולמים, כמו מתח, זמן או שימוש לא תקין במאגר.
4. בעיות העברה: בעיות בתהליך ההעברה, כגון בחירת קרום לא הולמת, זמן העברה או חיץ העברה.
5. בעיות חסימה: פיתרון החסימה עשוי להיות לא הולם או שזמן החסימה עשוי להיות ארוך מדי.
6. סוגיות מכתים: מגיב הכתמים עשוי להיות פג, חסר רגישות או להשתמש בו שלא כהלכה.

בעיות ציוד: הציוד עשוי לתקלה או שלא לכייל כראוי.

1. בעיות פעולה ניסיוניות: יתכן כי הפעולה הניסיונית לא מתקיימת, כגון כביסה לא מספקת או העמסת מדגם לא אחידה.
2. בעיות שינוי חלבון: חלבון היעד עשוי לעבור שינויים שלאחר התרגום המונעים זיהוי נוגדנים.
3. בעיות ביטוי חלבון יעד: לחלבון היעד עשוי להיות ביטוי נמוך מאוד או ללא ביטוי בתאים או ברקמות המתגלה.

II. רקע גבוה

סיבות אפשריות עשויות לכלול:

1. ריכוז נוגדנים גבוה: שימוש בנוגדנים רבים מדי עשוי להגביר את הכריכה הלא ספציפית, וכתוצאה מכך רקע גבוה.
2. בעיות באיכות נוגדנים: הנוגדן עשוי להיות בעל כריכה גבוהה לא ספציפית או צולב-תגובה עם חלבונים אחרים.
3. חסימה לא מספקת: פתרון החסימה אינו מצליח לכסות ביעילות אתרי כריכה לא ספציפיים על הממברנה, וכתוצאה מכך רקע גבוה.
4. בעיות ממברנה: הממברנה עשויה להיות באיכות או זיהום ירודה, מה שמוביל לרקע גבוה.
5. העברה לא שלמה: במהלך תהליך ההעברה, חלבונים עשויים שלא להעביר במלואם לממברנה, וכתוצאה מכך רקע גבוה.
6. כביסה לא מספקת: שלבי הכביסה אינם מצליחים להסיר ביעילות נוגדן בלתי מוגבל או זיהומים אחרים, מה שמוביל לרקע גבוה.
7. סוגיות מגיבים מכתים: מגיב הכתמים עשוי להיות רגיש מדי או לא יציב, וכתוצאה מכך רקע גבוה.
8. בעיות בציוד ניסיוני: הציוד עלול להיות דליפה או הפרעות, מה שמוביל לרקע גבוה.
9. בעיות מדגם חלבון: המדגם עשוי להכיל כמות גדולה של חומרים מפריעים, כמו מוצרי השפלה של חלבון או זיהומים אחרים.
10. בעיות פעולה ניסיוניות: יתכן כי הפעולה הניסיונית לא מתקנת, כגון זמן דגירה ממושך או טמפרטורה גבוהה.

III. להקות לא ספציפיות או גדלי פס חלבון שגויים

סיבות אפשריות עשויות לכלול:

1. יותר מדי קטעי תאים, וכתוצאה מכך רמות ביטוי חלבון שונות, מה שמוביל לגדלי פס לא עקביים או נוכחות של להקות מרובות.
2. השפלה של דגימת חלבון, וכתוצאה מכך משקל מולקולרי חלבוני נמוך יותר או נוכחות של להקות מרובות.
3. בדגימות חלבון המובעות in vivo עשויות להיות צורות שונות של שינויים כמו אצטילציה, מתילציה, אלקילציה, זרחן וגליקוזילציה, מה שמוביל לגדלי פס לא עקביים או נוכחות של להקות מרובות.
4. חלבון היעד מכיל מספר איזופורמים או גרסאות אחיזה, וכתוצאה מכך גדלי פס לא עקביים או נוכחות של להקות מרובות.